dsRNA ELISA  檢測試劑盒說明書

貨號：HG-DS001

產(chǎn)品簡介：

本試劑盒采用雙抗體夾心法原理，并偶聯(lián)生物i素-鏈霉親和素系統(tǒng)，用于定量檢測樣本中雙鏈RNA(dsRNA)含量，檢測的dsRNA 長度60 bp 及以上, 檢測的dsRNA 與其核酸序列無關(guān)。酶標板微孔中包被抗dsRNA 抗體，加入樣本后孵育洗滌，再加入生物i素化檢測抗體孵育，形成抗體-抗原-抗體復合物，再次洗滌后加入辣根過氧化物酶(HRP) 標記鏈霉親和素(streptavidin，SA）。經(jīng)過徹-底洗滌后加底物TMB顯色，TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，經(jīng)酸的終止作用轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中dsRNA 含量呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值)，根據(jù)標準曲線計算樣品中dsRNA濃度。

（1）檢測范圍：
無-修飾、pUTP 修飾dsRNA 檢測線性范圍0.0156-0.5pg/μL
N1-Me-pUTP 修飾dsRNA 檢測線性范圍0.0312-1pg/μL
5-OMe-UTP 修飾dsRNA檢測線性范圍0.0625-1pg/μL
（2）檢測限：
無-修飾、pUTP修飾、N1-Me-pUTP 修飾dsRNA 檢測限 0.001pg/μL
5-OMe-UTP 修飾dsRNA 檢測限0.01pg/μL
（3）定量限：
無-修飾、pUTP 修飾dsRNA 定量限0.0156pg/μL
N1-Me-pUTP 修飾dsRNA 定量限0.0312pg/μL
5-OMe-UTP 修飾dsRNA 定量限0.0625pg/μL
（4）精密度：CV%≤10%
（5）回收率：80%~120%

規(guī)格：

96T

應用：

適用于定量檢測樣本中dsRNA 的含量。

試劑盒組成：

備 注:未開封試劑盒，在2~8℃條件下有效期為12個月。

需自行準備的材料

◆酶標儀

◆去離子水

◆微孔板恒溫振蕩器

◆全新濾紙

◆微量移液器及吸頭

◆渦旋振蕩器

實驗前準備

1.將本次實驗所用試劑平衡至室溫（18~25°C）。

2.20×濃縮洗滌液用純化水按1：19 體積比稀釋成洗滌工作液。

3.將抗體管、HRP-SA 管和標準品管1000 rpm在使用前離心30s，以避免管壁及管蓋上殘留試劑。

4.將100×生物i素化檢測抗體和100×HRP-鏈霉親和素在使用前用稀釋液作100 倍稀釋后使用。

5. 無-修飾、pUTP 修飾dsRNA 標準品用STE buffer稀釋至1 、0.5 、0.25 、0.125 、0.0625 、0.0312 、0.0156、0 pg/μL。
N1-Me-pUTP 修飾dsRNA 標準品用STE buffer 稀釋至2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0 pg/μL。
5-OMe-UTP 修飾dsRNA 標準品用STE buffer 稀釋至4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0 pg/μL

標準品稀釋方法建議如下：

a）．無-修飾、 pUTP 修飾

操作步驟

（1）從室溫（18-25℃）平衡后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條加蓋封板膜后用自封袋密封放回2~8℃。
（2）設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加入不同濃度的標準品100μL，樣本孔中加入待測樣本100μL。
 *當不能夠確定待測樣品中的dsRNA含量時，應當用STE buffer 做多個稀釋倍數(shù)做檢測，以免含量過高不能夠讀取有效數(shù)值。
（3）用封板膜封住反應孔，室溫（18-25℃）下振板（500rpm）反應60min。
（4）棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（250μL），靜置30s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板4次。
（5）標準品孔和樣本孔中每孔加入工作濃度的生物i素化檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，室溫（18-25℃）下振板（500rpm）反應60min。
（6）棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（250μL），靜置30s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板4 次。
（7）標準品孔和樣本孔中每孔加入工作濃度的HRP-鏈霉親和素100μL，用封板膜封住反應孔，室溫（18-25℃）下振板（500rpm）反應30min。
（8）棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（250μL），靜置30s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板4次。
（9）每孔加入單組分底物顯色液100μL，用封板膜封住反應孔，室溫（18-25℃）靜置避光反應30min。
（10）每孔加入終止液50μL，立即進行檢測，設(shè)定酶標儀波長于450nm處( 建議用雙波長450nm/650nm）。

結(jié)果處理

1.標準曲線

2.實驗檢測結(jié)果

注意事項

1.顯色溫度和時間對實驗結(jié)果至關(guān)重要，應準確把握。
2.洗滌過程中應使洗滌液浸泡反應板30s后再甩干，以充分洗滌非特異性吸附的成分。
3.所有試劑使用前應充分搖勻，加樣時應將所加樣物加入酶標板孔中底部，避免加在孔壁上部，加樣時注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。
4.若發(fā)現(xiàn)濃縮洗滌液中有結(jié)晶，可在37℃水浴鍋中孵育，待結(jié)晶完-全溶解后再混勻稀釋至工作濃度。
5.樣本中應避免引入疊氮-化鈉（NaN3），疊氮-化鈉會破壞辣根過氧化酶活性，使檢測值偏低。
6.實驗操作過程中要嚴格避免RNase污染。
7.不可使用搖床代替振板機，若無振板機可采用室溫（18-25℃）靜置孵育，但靜置孵育會造成檢測靈敏度下降一倍左右。建議無-修飾、pUTP修飾標準品從2pg/μL開始稀釋，N1-Me-pUTP 修飾標準品從4pg/ μL開始稀釋，5-OMe-UTP修飾標準品從8pg/μL 開始稀釋，HRP-SA孵育時長由30min 調(diào)整至60min。

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